یک تیم بین المللی از محققان از کریستالوگرافی با زمان بسیار سریع برای ردیابی پیشرفت ترمیم DNA توسط آنزیم فتولیاز استفاده کرده اند. او می‌گوید این کار «اولین توصیف ساختاری یک چرخه کامل واکنش آنزیمی» است مانوئل ماستر-ریناکه مطالعه را رهبری کرد.
این زیست شناس مولکولی می گوید: اگرچه بسیاری از مراحل این فرآیند قبلاً مورد مطالعه قرار گرفته است، مطالعه جدید به طور قابل توجهی «با تجسم رقص زیرلایه و آنزیم» فراتر می رود. عزیز سنجر از دانشکده پزشکی دانشگاه کارولینای شمالی که موفق به دریافت این جایزه شد جایزه نوبل شیمی 2015 برای کارش بر روی مطالعات مکانیکی ترمیم DNA. به طور خاص، این مطالعه بر چالش ثبت رویدادهایی که در مقیاس‌های زمانی مختلف برای نقشه‌برداری هر مرحله آنزیمی از فرآیند رخ می‌دهند، غلبه کرده است. سانکار آن را “یک کار برجسته که مرزهای بلور نگاری حل شده با زمان را پیش می برد” می نامد.
“آنزیم ها کند هستند”
فوتولیازها آسیب DNA ناشی از اشعه ماوراء بنفش را در باکتری ها، قارچ ها، گیاهان و برخی حیوانات از جمله کیسه داران ترمیم می کنند. انسان و سایر پستانداران حاوی این آنزیم ها نیستند، اما ما نیز از آسیب ناشی از نور رنج می بریم. یکی از نتایج رایج، تشکیل دایمرهای سیکلوبوتان پیریمیدین (CPDs) است، که در آن دو باز پیریمیدین مجاور (تیمین یا سیتوزین) از طریق یک حلقه سیکلوبوتان چهار عضوی با هم ذوب می‌شوند. Maestre-Reyna، بیوشیمیست مؤسسه شیمی بیولوژیکی در تایپه، تایوان، می گوید: «تشکیل CPD عامل اصلی سرطان پوست است و پوست آفتاب سوخته همیشه حاوی ضایعات CPD است.
این آنزیم با نگه داشتن CPD در محل فعال خود، DNA را ترمیم می کند در حالی که کوآنزیم فلاوین آدنین دی نوکلئوتید (FAD) یک الکترون را به حلقه سیکلوبوتان در فرآیندی که خود توسط نور تحریک می شود، منتقل می کند. این باعث ایجاد یک واکنش رادیکال آزاد می شود که دو پیوند کربن-کربن را که پیریمیدین ها را در کنار هم نگه می دارند می شکند.
همه اینها به سرعت پس از فعال شدن FAD اتفاق می‌افتد: انتقال اولیه الکترون پس از 100 ثانیه اتفاق می‌افتد و دومین پیوند C-C پس از حدود 1 ثانیه شکسته می‌شود. اما پس از آن حدود 500 ns طول می کشد تا محل فعال آنزیم به حالت اولیه خود بازگردد و 200 میکرو ثانیه دیگر طول می کشد تا پیریمیدین های ترمیم شده از محل فعال خارج شده و DNA آزاد شود.
این بیوفیزیکدان می گوید: آنزیم ها کند هستند ماریوس اشمیت از دانشگاه ویسکانسین-میلواکی چرخه‌های کاتالیزوری در عرض میلی‌ثانیه کامل می‌شوند، اما رویدادهای اساسی مانند تشکیل پیوند و آرامش‌های محلی بسیار سریع هستند. تطبیق این دو مقیاس زمانی دشوار است.
برای پیگیری کل فرآیند، Maestre-Reyna و همکارانش کریستالوگرافی فوق سریع را بر روی کریستال‌های فتولیاز میکروبی و DNA حاوی CPD با استفاده از دو منبع لیزر الکترون آزاد (FEL) پرتو ایکس روشن انجام دادند. یک تیم که در سوئیس کار می کرد، داده ها را در مورد 10 ns اول واکنش جمع آوری کرد، در حالی که تیم دیگر، با استفاده از FEL در ژاپن، آرام سازی کمپلکس آنزیمی و آزادسازی DNA را از 10 ns تا 200 میکرو ثانیه مطالعه کردند.
ما باید پروتئین را خالص می‌کردیم، آن را فعال می‌کردیم، هم‌کریستالیزه می‌کردیم، کریستال‌ها را جمع‌آوری می‌کردیم و داده‌ها را ظرف 20 ساعت جمع‌آوری می‌کردیم.
Maestre-Reyna می گوید چالش اصلی این بود که تیم ها باید به سرعت برای جمع آوری داده ها کار می کردند. او می‌گوید: «فوتولیازها فقط در شکل کاملاً احیا شده خود فعال هستند، بنابراین همه آزمایش‌ها باید در شرایط بدون اکسیژن انجام می‌شدند». و از آنجایی که شکل احیا شده به راحتی اکسید می شود، آنها تخمین زدند که تنها حدود 20 ساعت قبل از غیرفعال شدن مجدد آن زمان داشتند. او می‌افزاید: «ما باید پروتئین را خالص می‌کردیم، آن را فعال می‌کردیم، هم‌کریستالیزه می‌کردیم، کریستال‌ها را جمع‌آوری می‌کردیم و آنها را برای جمع‌آوری داده‌ها آماده می‌کردیم، و سپس در واقع داده‌ها را، همه در محل، در کمتر از 20 ساعت جمع‌آوری می‌کردیم».
استاد رینا تاکید می کند که کار فقط با یک تیم بزرگ چند رشته ای امکان پذیر است. این شامل مینگ دو تسای در آزمایشگاه تایوان، که کارهای زیادی بر روی پایه ساختاری ترمیم DNA انجام داده است، لارس-الیور اسن از دانشگاه فیلیپس ماربورگ (“یکی از مهم ترین دانشمندان فوتولیز در جهان”)، جونپی یاماموتو از دانشگاه اوزاکا (“احتمالا تنها شیمیدان مصنوعی در جهان که قادر به تولید DNA آسیب دیده با نور در مقیاس های عظیم مورد نیاز است”) و آنتوان رویان از دانشگاه گرنوبل آلپ، کارشناس عملکرد طیف سنجی در کریستال ها
یکی از مؤلفه‌های کلیدی که تاکنون درک نشده بود، خوشه‌ای از پنج مولکول آب در محل فعال است. این خوشه، پیوند هیدروژنی با بخشی از پروتئین، به نظر می‌رسد که میل سایت فعال را به CPD ها تنظیم می‌کند و به آن اجازه می‌دهد تا زمانی که انتقال اولیه الکترون اتفاق می‌افتد، به سرعت سازماندهی مجدد کند – ایده‌ای که قبلاً حدس‌زنی بود که کار جدید آن را تأیید می‌کند. استاد رینا همچنین می‌گوید: «در حالی که ما با آگاهی بسیار خوبی از آنچه در اولین نانوثانیه یا بیشتر انتظار داریم، وارد عمل شدیم، بعداً چه اتفاقی می‌افتد. [when the bases are released] این منطقه بسیار ناشناخته بود.
